关键词：牛  冷冻胚胎  直接移植法

    牛冷冻胚胎解冻后能直接移植给受体牛的胚胎冷冻保存方法，对在商业条件下应用胚胎移植技术最有价值。传统冷冻法通常在胚胎解冻后用蔗糖溶液分步脱除搞冻剂后方能移植，而直接移植法简化了移植前胚胎的处理，不公可消除由于脱去搞冻剂所带来的技术误差，而且操作简便、省时、不需专门设备与器械，就象细管冷冻精液输精一样，胚胎解冻后可立即移植。实现上述目的的关键问题是寻求一种对胚胎具有渗透性高的抗冻剂，以使胚胎解冻后直接复水，并获得较高的活力。为此，有人曾选用甘油和蔗糖混合液一步解冻（Massip等，1984），又有人用丙二醇（SuzuKi等，1992）作为抗冻剂冷冻牛胚胎，解冻后直接在PBS中复水脱除抗冻剂。阳年生等（1996）对胚胎一步脱除抗冻剂的冷冻方法也进行了深入的试验研究。然而，到目前止，大多数研究采用的是牛体外受精胚胎，在国内善于体骨受精的胚胎用不同抗冻剂冷冻－解冻后直接移植的效果迄今报道少见。本研究目的是确定乙二醇或丙二醇作为抗冻保护剂冷冻－－解冻牛体内膛胎进行体外培养，以及在生产条件下直接移植的效果。

　　1  材料与方法

　　1.1 胚胎体内生产

    试验以天津市奶牛育种站饲养的荷斯坦泌乳母牛为供体。自然发情后第9～13天用高活必FSHP（中国科学院动物研究所研制）配合PG（上海计划生育研究所生产）进行超数排卵处理。超排发情后间隔10～12小时以美国、加拿大纯种公牛细管冻精输精2～3次。授精后第7或第8天用全封闭自动冲卵装置（FHK，日本，富士平工业公司）进行非手术采卵。回收的冲卵液经经孔径为0.75微米的胚胎过滤器滤过后，将少量残液置于20～40倍实体显微镜下检出胚胎，在NiKon倒置镜下按形态学分类法评定胚胎品质。选择A级或B级紧缩桑椹胚或囊胚用于冷冻试验。

　　1.2 胚胎在含20％FCS（胎犊血清）的M－PBS液中清洗3次后分别按下述冷冻和解冻方法处理。（1）直接移植法：按2种抗冻剂分组：①组为1.8M乙二醇（EG）；②组为1.6M丙二醇（PD）。在室温下将胚胎一步移入1.8M乙二醇＋M－PBS＋20％FCS或1.6M丙二醇＋M－PBS＋20％FCS的冷冻液中，随后装入0.25毫升塑料细管，胚胎在冷冻液中至上机冷冻前的平衡时间为10～20分钟。在－7℃，将胚胎直接放入程控冷冻仪（ET－1型，FHK，富士平工业公司）的洒精浴槽内，2分钟后植冰，在－7℃下停留8分钟。然后以0.3℃／分的速率降温至－30℃，取出胚胎细管，直接投入液氮中保存。解冻时，从罐中取出细管在空气中停留5～10秒钟后，浸入30℃水浴中（见冰晶消失为止），然后将胚胎直接注入含M－PBS＋20％FCS液的皿内，15分钟后用该液清洗2次。

　　（2）常规法（对照组）：使用的抗冻剂为1.4M甘油（Gly）。在室温下将胚胎分步移入0.5M、1.0M和1.4M甘油＋M－PBS＋20％FCS的冷冻液中，每步停留10分钟。然后将胚胎移入1.4M甘油冷冻液中停留10分钟。然后将胚胎装入1.4M甘油冷冻液停留10分钟后装入细管内。在－5.3℃，将胚胎直接放入冷冻仪内，植冰与降温等程序均与1法相同。在37℃水浴中解冻后，将胚胎依次移入1.0M甘油+0.3M蔗糖、0.5M甘油＋0.3M蔗糖和0.3M蔗糖＋M－PBS＋20％FCS的解冻液中分步脱除抗冻剂每步停留10分钟。最后用M－PBS＋20％FCS液清洗2次。

　　1.3 体外培养与膛胎存活力评定将脱除抗冻剂的各组胚胎移入预先覆盖矿物油的TCM－199＋20％FCS培养小滴中，置CO₂培养箱（温度：38℃；CO₂：5％）内培养24～48小时，发育至下一阶段且形态好的胚胎判为存活胚胎。

　　1.4 移植及妊娠诊断：受体来自静海县奶类项目办实验牛场和市奶牛发展中心饲养的荷斯坦良成母牛及部分成年母牛。选择自然发情或经PG处理后同期发情、生殖器官无异常、黄体发育良好的母牛作受体。和直接移植法和常规法冷冻保存数日的胚胎携农场解冻后分别做如下处理：前者不脱除搞冻剂，直接移植；后者分步脱除抗冻剂后，按常规操作非手术移植到子宫角深部。移植后60～90天通过直肠检查诊断妊娠。

　　2  结果与结论：冷冻保存体内胚胎共191枚，解冻其中的96枚进行培养，48小时后各组胚胎的发育情况见表1。 

表1不同冷冻方法及不同抗冻剂冷冻－解冻体内胚胎后体外培养结果

冷冻方法	抗冻剂种类 及其浓度	冷冻 胚胎数	解冻 培养胚数	存活 胚胎数	存活率（％）
直接移	1.8M乙二醇	34	33	28	84.8（a）
植法	1.6M丙二醇	32	29	19	65.5（b）
常规法	1.4M甘油	30	30	26	86.7（c）

注：卡方检验：a与bP<0.05，a与cP<0.05

    用1.8M乙二醇作抗冻剂直接移植法冷冻－解冻胚胎组的存活率显高于1.6M丙二醇组（84.8%比65.5%，P<0.05），而与对照组（1.4M甘油常规法）的存活率（86.7%）相近（P>0.05）。研究证明，抗冻保护剂对牛胚胎的渗透性高低直接影响胚胎的损伤程度。许多人报道了乙二醇、丙二醇以及甘油与蔗糖混合作为抗冻剂冷冻牛胚胎，解冻后直接在PBS中复水，一步脱除抗冻剂的试验效果。阳年生等人（1996）证明，用乙二醇或甘油＋蔗糖作抗冻剂冷冻牛体外受精胚胎，经一步脱除抗冻剂后的孵化率均明显高于丙二醇（前者分别为73.24%和77.27%；后者为47.9%）。本试验结果表明，用1.8M乙二醇冷冻牛体内胚胎，解冻后直接在M-PBS中一步脱除抗冻剂的体外存活率（84.8%）显著高于1.6M丙二醇组（65.5％），与阳年生等人的结果相似。同时说明用乙二醇作抗冻剂不仅适用于体内胚胎冷冻，而且其效果优于丙二醇。

　　2.2  为确定乙二醇或丙二醇冷冻－－解冻胚胎在母体内的发育率，在生产条件下比较两者的直接移植效果。共解冻95枚胚胎，移植胺体91头，其中妊娠42头，移植妊娠率为46.2%，不同抗冻剂的移植结果见表2。

表2 不同冷冻方法采用不同抗冻剂冷冻－解冻体内胚胎移植效果

冷冻方法	抗冻剂种类 及其浓度	解冻 胚胎数	移植 受体数	妊娠数	移植妊娠率 （％）
直接移	1.8M乙二醇	33	33	16	48.5（a）
植法	1.6M丙二醇	30	30	12	40.0（b）
常规法	1.4M甘油	32	28	14	50.0（c）

注：卡方检验：a与bP<0.05，a与cP>0.05

    以1.8M乙二醇为抗冻剂冷冻体内胚胎，解冻后直接移植的妊娠率为48.5％，显著高于1.6M丙二醇组的40.0％，（P<0.05），但与对照组（1.4M甘油）的50.0％无明显差异（P>0.05）。这与堂地修（1996）在生产条件下大群试验结果相符，即1.6M丙二醇组的移植妊娠率低于1.8M乙二醇或1.4M甘油组（对照组），而乙二醇与甘油组之间的移植妊娠率无明显差异。

　　2.3  综上所述，用乙二醇作抗冻剂按直接移植法冷冻－解冻牛胚胎获得的体外与体内发育率与甘油冷冻分布复水常规法的结果相似， 但前者简单、方便、适于大面积推广应用。据此，乙二醇是一种有效的冷冻保护剂，在生产条件下，牛冷冻胚胎的直接移植法可以接受。