成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

　　成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。

　　6　成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

　　徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。

　　为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。

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